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· P R o C e S o S I N d USTRIA l e S ·

ma-Aldrich, Steinheim, Alemania) como en 30 para la furosina, lisina y lisinoala- utilizando el procedimiento CORR de
estándar interno. El eluyente A era agua nina y en 35 para los otros compuestos, SAS [15].
Millipore de grado UPLC conteniendo y la anchura m/z sobre el fragmento fue
0,1 % (v/v) de ácido fórmico y el elu- establecida en 1. Se utilizó una curva de
yente B era acetonitrilo conteniendo 0,1 calibración por estándar externo para · Resultados y discusión
% (v/v) de ácido fórmico. Las muestras la furosina, la lisina, la lisinoalanina, la
ε
fueron analizadas utilizando un sistema lantionina, la N -carboximetil-lisina y la Se observaron efectos lineales (P <
ε
RP-UHPLC Accela (Thermo Scientific, N -carboxietil-lisina con concentracio- 0,001) y cuadráticos (P = 0,001) del
San Jose, CA, EE.UU.) con una pre- nes de 0,01; 0,1; 1; 2,5; 5 y 10 mg/l de tiempo de tostado sobre la solubilidad
columna Acquity BEH Amide Vanguard cada estándar para calcular el contenido del N de la HC00 en agua a un pH de 8,0
(2,1 × 50 mm, 1,7 μm tamaño de partícu- de cada compuesto. Los compuestos fue- (Tabla 2). La solubilidad parece redu-
la) y una columna Acquity UPLC BEH ron cuantificados utilizando la curva de cirse más rápidamente con los tiempos
300 Amide (2,1 × 150 mm, 1,7 μm tama- calibración por estándar externo trazan- de tostado más cortos que con los más
ño de partícula). La columna se mantuvo do el área del pico MS dividido por el prolongados. La reducción en la solu-
a 35 ºC y el volumen de inyección fue 1 área de pico MS de la Lys marcada uti- bilidad del N puede estar causada por
μl. El perfil de la elución fue el siguien- lizada como estándar interno. Los datos la agregación física de proteínas luego
te: 0-2 min isocrática hasta 80 % B, 2-3 fueron obtenidos y analizados utilizando del desplegamiento de las mismas [10].
min gradiente lineal desde 80 % B hasta el software XCalibur versión 2,2 (Ther- Además, también es posible que las
65 % B, 3-5 min isocrática hasta 80 % mo Scientific). modificaciones químicas en las proteí-
B, 5-7 min gradiente lineal desde 65 % nas (por ejemplo, formación de enlaces
B hasta 40 % B, 7-10 min isocrática has- disulfuro intermoleculares, reacciones
ta 40 % B, 10-12 min gradiente lineal Análisis estadístico de Maillard), hayan estado involucradas
desde 40 % B hasta 80 % B y 12-28 min en la reducción de la solubilidad [10]. Es
isocrática hasta 80 % B. El caudal fue Las regresiones lineales y cuadráticas se posible que ambos fenómenos (agrega-
350 μl/min. Los datos de la espectrome- ajustaron utilizando el tiempo de tosta- ción física y modificaciones químicas)
tría de masas fueron obtenidos utilizan- do como efecto fijo en el modelo. Los reduzcan la accesibilidad a las proteínas
do un LTQ-VelosPro (Thermo Scienti- efectos lineales y cuadráticos fueron para la hidrólisis enzimática.
fic) equipado con una sonda calentada considerados significativos si el valor de
para ionización por electrospray (ESI P era inferior a 0,05 y como tendencias
por sus siglas en inglés), acoplada al sis- si el valor de P se ubicaba entre 0,05 y Cinética de la hidrólisis
tema UHPLC. El voltaje del capilar se 0,10. Las correlaciones entre los pará-
estableció en 3 kV. El caudal del gas de metros de la hidrólisis y la distribución El incremento del tiempo de tostado
impulsión se estableció en 20 y el caudal del tamaño molecular fueron realizadas afectó el perfil de la hidrólisis de la
del gas auxiliar en 5 (unidades arbitra-
rias). Se utilizó un método de monitoreo Tabla 2 - Solubilidad del N a un pH de 8,0 de la HC00 y los parámetros cinéticos para las curvas de la
HC00 tostada a distintos tiempos y las fracciones solubles e insolubles separadas de dichas harinas
selectivo de reacciones (selected reac- de colza.
tion monitoring - SRM) para el análisis
de fragmentos en modo de ión negativo tiempo de solubilidad n Hc00 Fracción de Fracción de
para la lisinoalanina y en modo de ión tostado de la Hc00 proteínas solubles proteínas insolubles
(% de n total) GH max (%) k (/m×s) GH max (%) k (/m×s) GH max (%) k (/m×s)
positivo para otros compuestos. La ener-
0 min 31,3 20,0 6,8E−05 14,7 1,2E−04 19,5 4,0E−05
gía normalizada de colisión se estableció 20 min 21,1 18,3 8,0E−05 14,8 1,4E−04 22,8 4,0E−05
40 min 17,7 19,2 7,0E−05 15,3 1,3E−04 21,1 4,3E−05
Tabla 1 - Selección de condiciones de 60 min 15,3 19,0 6,7E−05 14,3 1,5E−04 21,4 2,4E−05
monitoreo de reacciones 80 min 12,3 20,4 5,0E−05 15,8 1,6E−04 21,9 2,2E−05
100 min 11,4 20,2 4,8E−05 14,5 1,7E−04 21,7 2,4E−05
masa original a Fragmento
compuesto (da) (m/z) 120 min 9,9 21,7 3,4E−05 15,3 1,4E−04 22,3 1,5E−05
Lisina 146 130 EEM 0,2 0,3 4,5E−06 0,2 6,7E−06 0,3 3,0E−06
13 C 6 N 2 -Lisina 154 137 Valor de P
15
N -carboximetil-lisina 204 84,130 Lineal <0,001 0,006 b <0,001 c 0,47 0,18 0,34 <0,001 d
ε
a
Lantionina 208 120 Cuadrático 0,001 0,06 0,07 0,96 0,34 0,86 0,87
N -carboxietil-lisina 218 84,130 GH max , grado máximo de hidrólisis; k, velocidad de hidrólisis proteica; HC, harina de colza; EEM, error estándar de la media.
ε
Lisinoalanina 233 128,145 a Solubilidad de N = 28,84 − 0,33 × tiempo + 0,0015 × tiempo 2 (R 2 = 0,95)
b GH max de la HC00 = 18,33 + 0,023) x tiempo (R 2 = 0,52)
Furosina 255 84,130 c k de la HC = 8,30E−05 − 3,71E−07 × tiempo (R 2 = 0,80)
a La masa original es la masa molecular de los compuestos d k de los insolubles = 4,46E−05 − 2,40E−07 × tiempo (R 2 = 0,78)
antes de la ionización
484 A&G 108 • Tomo XXVII • Vol. 3 • 480-491 • (2017)