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Los efectos del tiempo de tostado sobre la hidrólisis digestiva de las proteínas solubles e insolubles de la harina de colza 00

cedió a ajustar 10 ml de una suspensión reacciones de segundo orden, que se te del hidrolizado, se calentó a una tem-
líquida conteniendo 1 mg de N/ml a un describen en la ecuación 2: peratura de 99 ºC durante 15 minutos y
pH de 8,0 en una unidad de titulación luego se centrifugó (16.100×g, 10 minu-
(719 S Titrino, Metrohm, Herisau, Sui- GH tos, temperatura ambiente). Además, se
max
za) y a una temperatura de 39 ºC utili- GH (%) = GH - analizaron muestras tomadas de la frac-
max
1 + k × t × GH
zando NaOH 0,1 M. En este punto, se max ción soluble en agua de la HC después
adicionó 1 ml de una solución de enzi- de la centrifugación (16.100×g, durante
mas conteniendo 1,61 mg de tripsina, En donde, GH max es el grado máximo 15 minutos, a temperatura ambiente).
3,96 mg de quimotripsina y 1,18 mg de de hidrólisis (%), k es la constante de Dichas muestras fueron analizadas en
peptidasa intestinal porcina y se inició la velocidad de hidrólisis (/M×s), y t es un microsistema ÄKTA (GE Healthcare,
una titulación de 120 minutos. Se utilizó el tiempo de la hidrólisis. El ajuste de Uppsala, Suecia) utilizando una columna
dicho procedimiento para la HC00 inte- dicho modelo se realizó utilizando el Superdex 75 (GE Healthcare) a un cau-
gral y las fracciones insolubles. procedimiento MODELO de SAS [15]. dal de 100 μl/min con detección UV a
220 nm. Como eluyente se utilizó solu-
Con respecto a la fracción soluble, se ción tampón de fosfato de sodio 10 mM
obtuvieron distintas concentraciones de Solubilidad del nitrógeno con un pH de 7,0 conteniendo NaCl 150
N en las fracciones solubles solubilizan- mM y 2 % (p/v) de SDS. El volumen de
do la HC00 en agua. Se utilizó agua des- Se suspendieron 500 mg de HC00 en 10 inyección fue 50 μl. Se obtuvo una curva
mineralizada para diluir dichas solucio- ml de agua y la suspensión se ajustó a de calibración de los volúmenes de elu-
nes a la concentración de la más baja de un pH de 8,0 utilizando una solución de ción en la columna utilizando treonina
las soluciones (0,30 mg N/ml) a un volu- NaOH 2M. La suspensión se agitó duran- (119 Da), prolina-glicina-glicina (229
men de 10 ml. Las soluciones se ajusta- te 20 minutos a temperatura ambiente y Da), vitamina B12 (1.355 Da), lisozima
ron a un pH de 8,0 en la unidad de titu- luego se centrifugó (16.100×g, durante (14.307 Da), β-lactoglobulina (18.400
lación utilizando una solución de NaOH 15 minutos, a temperatura ambiente). Se Da) y ovoalbúmina (42.700 Da). Las
0,05 M. En este punto, se adicionó 1 ml procedió a secar una alícuota (0,3 ml) áreas debajo de la curva se integraron
de una solución de enzimas conteniendo en estufa a una temperatura de 60 ºC manualmente y las proporciones de pép-
0,48 mg de tripsina, 1,19 mg de quimo- durante la noche y luego se analizó para tidos basados en la respuesta AU en cada
tripsina y 0,35 mg de peptidasa intestinal obtener el contenido de N. La solubili- región (>10, 10–1,5 y <1,5 kDa), y fue-
porcina y se inició una titulación de 120 dad del nitrógeno de las fracciones de ron calculados con respecto al área total
minutos. Se utilizó la misma relación proteínas insolubles se determinó en por debajo de la curva.
sustrato/enzima para la hidrólisis de la agua, utilizando solución tampón de fos-
HC00 y para las fracciones solubles e fato de sodio de 100 mM con pH 7,5; y
insolubles. Todas las hidrólisis fueron el mismo tampón conteniendo 2 % (p/v) Productos de la reacción de Maillard,
realizadas por duplicado. de SDS o de ditiotreitol (DTT)10 mM; o compuestos entrecruzados y lisina
ambas, 2 % (p/v) de SDS y DTT 10 mM.
El volumen de álcali adicionado se utili- Brevemente, se procedió a adicionar 1,5 Los contenidos de furosina,
zó para el cálculo del grado de hidrólisis ml de dichas soluciones a 75 mg de las N -[carboximetil]-lisina, lisinoalani-
ε
según se muestra en la ecuación 1: fracciones de proteínas insolubles. Las na, lantionina, N -[carboxietil]-lisina y
ε
suspensiones fueron agitadas durante lisina en la HC y las fracciones de pro-
Vb × Nb 20 segundos y mezcladas en un agitador teínas insolubles fueron cuantificados
DH (%) = × 100 rotativo tipo “head-over-tail” durante 20 usando cromatografía liquida de ultra-
α × mp × htot
minutos a 20 rpm. Luego de la centrifu- alta eficiencia/espectrometría de masas
gación (16.100×g, durante 15 minutos, (UHPLC-MS por sus siglas en inglés).
En donde: Vb es el volumen adicionado a temperatura ambiente), se procedió a Las muestras (10 mg) fueron hidroliza-
(ml), Nb es la normalidad de la solución secar 0,3 ml de sobrenadante en estufa a das con 1 ml de solución 6M de HCl a
de titulación; α es el grado de disocia- 60 ºC durante la noche y luego se anali- una temperatura de 110 ºC durante 24
ción del grupo α-NH (en este caso, zó para obtener el contenido de N. horas. Los tubos se secaron bajo un flujo
2
0,794 a 37 ºC y pH 8,0), mp es la masa de N y el material seco fue suspendido
2
de la proteína (g) y htot es la cantidad nuevamente en 1 ml de agua Milli-Q
total de enlaces peptídicos por gramo de Cromatografía de Exclusión por grado UPLC, sonicado y centrifugado
proteína (7,8 meq/g) [14]. Tamaño (CET) (16.100×g; durante 3,5 min a temperatu-
ra ambiente). El sobrenadante fue dilui-
El modelado de las curvas del grado de A continuación de la hidrólisis, se obtu- do 50 veces en el eluyente A que conte-
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hidrólisis estuvo basado en cinéticas de vo una muestra de 1,5 ml de sobrenadan- nía 1 mg/l (p/v) de C N -lisina (Sig-
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A&G 108 • Tomo XXVII • Vol. 3 • 480-491 • (2017) 483