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· I NVESTIGACIÓN Y dESARR ollo ·

La determinación de la actividad de la resultó simple, efectiva y escalable. La W. and Zimmermann, P. (2008) Genevestigator
V3: a reference expression database for the meta-
PLA2 durante el proceso de purifica- GmsPLA2 es una nueva enzima de tipo analysis of transcriptomes. Advances in Bioinfor-
ción, mostró la presencia de inhibidores PLA2 que fue previamente identifica- matics 2008, 420747.
competitivos, llamados así porque el da y caracterizada por nosotros, y en el - Kim, S., Wang, Y., Lee, K., Park, Z., Park, J., Wu,
J., Kwon, S., Lee, Y., Agrawal, G., Rakwal, R.,
sustrato y el inhibidor compiten por el presente trabajo hemos desarrollado un
Kim, S., Kang, K. (2013) In-depth insight into in
mismo sitio (Cornish-Bowden, 1995). procedimiento novedoso, simple y rápi- vivo apoplastic secretome of rice-Magnaporthe
Experimentalmente, esto fue verificado do para obtenerla directamente del apo- oryzae interaction. J. Proteomics 78, 58-71.
en el ensayo enzimático por el hecho de plasto de la raíz de la soja. La metodo- - Kingsbury, N. and McDonald, K. (2014) Quan-
titative evaluation of E1 endoglucanase recovery
que la actividad de la PLA2 se redujo logía aquí aplicada tiene una proyección
from tobacco leaves using the vacuum infiltra-
mientras que el volumen del FA aumen- tecnológica que resulta apropiada para la tion-centrifugation method. Biomed Res. Int. vol.
tó. Se podría interpretar como un incre- obtención de una enzima lipolítica valio- 2014, Article ID 483596, 10 pp.
mento de la presencia del inhibidor des- sa para la industria alimentaria. - Lee, H., Bahn, S., Shin, J., Hwang, I., Back, K.,
Doelling, J. and Ryu, S. (2005) Multiple forms of
plazando al sustrato de fosfolípidos en el
secretory phospholipase A2 in plants. Prog. Lipid
sitio activo de la PLA2. Res. 44, 52-67.
5. Referencias - Lohaus, G. Interaction between phloem transport
En base a nuestros conocimientos sobre and apoplastic solute concentrations. In: Sattel-
macher, B. and Horst, W. (eds.), The apoplast of
la composición del fluido apoplástico de - Agrawal, G., Jwa, N., Lebrun, M., Job, D. and
higher plants: compartment of storage, transport
la soja, estas moléculas inhibidoras eran Rakwal, R. (2010) Plant secretome: Unlocking and reactions, 323-336. 2007 Springer.
secrets of the secreted proteins. Proteomics 10,
compatibles con las fitoalexinas, del tipo - Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B.,
1–29. Hussmann, M., Muehling, K. (2001) Is the
isoflavonas (Vargas et al., 2014). Sin - Boudart,G., Jamet,E., Rossignol, M., Lafitte1, C., infiltration-centrifugation technique appropriate
embargo, la mayoría de las mismas fue- Borderies, G., Jauneau, A., Esquerré-Tugayé, M. for the isolation of apoplastic fluid ? A critical
ron removidas aparentemente en el paso and Pont-Lezica, R. (2005) Cell wall proteins in evaluation with different plant species. Phisiolo-
apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes:
de la columna Sephadex G-25 durante la gia Plantarum 111, 457–465.
Identification by mass spectrometry and bioinfor- - Lowry, O. H., Rosenbrough, N. J.,Farr, A. L. and
purificación de la PLA2 (ver Tabla). El matics. Proteomics 2005, 5, 212–221. Randall, R. J. (1951) Protein measurement with
último paso de purificación, la ultrafiltra- - Berg, O., Gelb, M., Tsai, M. and Jain, M. (2001) the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193,
ción con Vivaspin con un corte de peso Interfacial enzymology: the secreted phospholi- 265-275.
pase A2-paradigm. Chem. Rev. 101, 2613-2654. - Maksimovic, J., Zivanovic, B., Maksimovic, V.,
molecular de 30.000, llevó a un incre-
- Cornish-Bowden, A. Fundamentals of Enzyme Mojovic, M., Nikolic, M. and Vucinic, Z. (2014)
mento 617 veces superior de la actividad Kinetics. Portland Press. London UK (1995). Filter strip as a method of choice for apoplastic
específica de la PLA2 (factor de purifi- - D’Arrigo, P.; Servi, S. (2010) Synthesis of lyso- fluid extraction from maize roots. Plant Science
cación) y a una actividad de retención de phospholipids. Review. Molecules 15, 1355-1377. 223, 49-58.
- De Maria L., V. J., Oxenbøll KM, Svendsen A, - Mansfeld, J. (2009) Plant phospholipases A2:
58 % (rendimiento) para la fracción infil-
Patkar S. (2007) Phospholipases and their indus- perspectives on biotechnological applications.
trada (Tabla 1). Dicho comportamiento trial applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. Review. Biotechnol Lett 31: 1373-1380.
es consistente con el peso molecular bajo 74, 290-300. - Madoery, R. y Minchiotti, M. (2006) Un método
normal de las PLA2 secretoras, como - Dijkstra, A. (2017) About water degumming and espectrofotométrico directo y continuo para la
the hydratation of non-hydratable phosphatides. determinación de actividad fosfolipasa A2. Lab-
sucede con la GmsPLA2 (aproximada-
Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2017, 119-130. Ciencia 1 (02/2006), 13-15.
mente 14 kDa) (Minchiotti et al., 2008). - Gupta, R., Lee, S., Agrawal, G., Rakwal, R., - Mariani, M. E., Villareal, M., Leyva, E.,
Park, S., Wang, Y. and Kim, S. (2015) Understan- Madoery, R. and Fidelio, G. (2012) In silico and
ding the plant-pathogen interactions in the con- in vitro characterization of phospholipase A2 iso-
4. Conclusiones text of proteomics-generated apoplastic proteins forms from soybean (Glycine max). Biochimie
inventory. Front. Plant Sci. 6: article 352. 94: 2608-2619.
- Hruz ,T., Laule, O., Szabo, G., Wessendorp, F., - Mariani, M. E., Madoery, R., Fidelio, G. D. (2015)
El FA obtenido aplicando el procedi- Bleuler, S., Oertle, L., Widmayer, P., Gruissem, Kinetic characterization, optimum conditions for
miento de infiltración al vacío-centrifu-
gación a las raíces de soja y usando una Tabla 1 - Purificación de la GmsPLA2 apoplástica
mezcla de Tris-CaCl2 como solución
para infiltración, desarrolló una activi- actividad pla2 rendimiento Factor de
paso Fracción proteína total
dad específica de la PLA2 por encima (u/ml) (u/mg) purificación
(ml) (mg/ml) (u) (%)
de 400 veces más a la de los homoge- Filtración +
neizados de las semillas de soja. Partir Microfiltración 8,5 9,5±0,7 107,7±6,3 11,3 916 100 1
de un extracto crudo mucho más limpio, Sephadex G-25 11,6 0,58±0,06 61,4±3,4 105,9 712 77,7 9,3
Ultrafiltración
permitió simplificar el proceso posterior (retentato) 4,0 1,2±0,08 79,3±4,1 66,1 317 34,6 5,9
de purificación alcanzando un factor ele- Ultrafiltración 7,6 0,01±0,001 69,7±3,5 6.970 530 57,9 617
vado de purificación de la GmsPLA2. (infiltrado)

Además, la purificación usando disposi- Los datos informados para el total de proteína y la determinación de la actividad de la PLA2 representan el promedio de los
experimentos realizados por duplicado ± error absoluto.
tivos de ultrafiltración en el laboratorio

636 A&G 109 • Tomo XXVII • Vol. 4 • 630-637 • (2017)