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Fosfolipasa A2 secretora recuperada directamente del apoplasto de la raíz de soja (Glycine max) para su uso en la industria alimentaria

te del método de infiltración al vacío- las proteínas adheridas a la pared celular do una mezcla de 25 mM Tris–50 mM
centrifugación, incluye la agitación pre- que otras sales, cualquiera fuese la clase CaCl2, respectivamente. La presencia de
via de los segmentos seccionados del de proteínas considerada (Boudart et al., cloruro de calcio en las soluciones para
tejido en una solución tampón basada 2005). En el presente trabajo, las Tris 50 infiltración pareció crítica para alcanzar
en calcio durante 1 hora, seguida por la mM y CaCl2 20 mM mostraron un fuer- un poder extractivo elevado, ya que la
infiltración al vacío, la centrifugación y te poder extractivo para la PLA2. Por lo reducción de la concentración a 5 mM
la precipitación de fenoles. Este método tanto, estas soluciones para infiltración en una mezcla de Tris-CaCl2 resultó en
produce una mayor cantidad de proteí- fueron combinadas, alcanzando con esto un menor rendimiento de PLA2. Esto
nas apoplásticas que el método clásico el mayor poder extractivo. Las raíces mostró que al menos para la PLA2, el
de infiltración al vacío-centrifugación seccionadas de las semillas germinadas poder extractivo fue dependiente del
(Gupta 2015, Kim et al., 2013). Las pro- durante 8 días desarrollaron los mayores cloruro de calcio que podría mejorar la
teínas más identificadas fueron liberadas rendimientos y actividades específicas extracción de las proteínas débilmente
por el cloruro de calcio, que solubilizó de la PLA2: 46 U/g y 23 U/mg usando adheridas a la pared celular (Gupta et al.,
iónicamente y de manera más eficiente a 50 mM Tris; y 64 U/g y 22 U/mg usan- 2015). Además, y en base al trabajo de
Kim et al., (2013), se incluyó agitación
Figura 4 - Volumen de recuperación del FA a baja velocidad (1 hora) en un agitador
tipo shaker antes del paso de infiltración.
Este pretratamiento mejoró claramen-
te la recuperación de la actividad de la
PLA2 (Figura 5). El fortalecimiento de la
acción del cloruro de calcio por la cual la
PLA2 se libera de la pared celular podría
ser interpretado como un efecto físico.

El FA obtenido a partir de las raíces de
las semillas de soja germinadas durante
8 días, usando una mezcla de Tris-CaCl2
desarrolló una actividad específica pro-
medio de la PLA2 (U/mg proteína) 400
veces superior a la desarrollada por un
homogeneizado inicial obtenido a par-
tir del procesamiento completo de las
semillas usado en un trabajo precedente
de los autores (Minchiotti et al., 2008).
El FA representó un extracto primario
relativamente limpio, que simplificó
Figura 5 - Poder extractivo para la PLA2 de 50 nM de solución tampón Tris
el proceso purificador posterior de la
GmsPLA2. Además, la recuperación de
la actividad PLA2 (U/g de tejido pro-
cesado) fue 21,3 veces superior en la
extracción directa a partir del apoplasto
de la raíz. La metodología aplicada aquí
basada en el aislamiento de la proteína
deseada directamente del apoplasto de la
raíz de la soja, como así también el pro-
ceso posterior de purificación son total-
mente transferibles a gran escala. Como
próximo desafío, las investigaciones
futuras sobre expresión de la GmsPLA2
podrían incluir la inducción de la síntesis
de enzimas nativas por la inoculación de
disparadores naturales involucrados en
el mecanismo de defensa de las plantas
(Vargas et al., 2014).

A&G 109 • Tomo XXVII • Vol. 4 • 630-637 • (2017) 635