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· I NVESTIGACIÓN Y dESARR ollo ·

de la actividad específica de la PLA2 se les. Cuando usamos raíces de soja como otras sustancias. En principio, una solu-
obtuvieron usando semillas germinadas muestra y agua destilada como medio ción para infiltración ideal debe cumplir
(Figura 1), fueron en detrimento de la de infiltración obtuvimos una actividad las siguientes condiciones, i) mantener la
muy baja cantidad de proteínas liberadas (U/g) global de la PLA2 relativamente presión osmótica para prevenir el colap-
(Figura 3). Además, los mayores volú- elevada pero una actividad específica so de las membranas plasmáticas y ii)
menes de FA fueron obtenidos a partir de baja (Figura 2) . Este hecho podría ser rigor o poder extractivo para remover
las raíces aisladas, y esto es importante interpretado como un efecto osmótico. las proteínas adheridas a la pared celular
desde el punto de vista operativo (Figura Por esto, el efecto de la presión osmótica (Witzel et al., 2011; Zhang et al., 2009).
4). Por estas razones, las raíces fueron podría actuar promoviendo el colapso de
seleccionadas como muestra tipo. Otros las membranas biológicas, contaminando El método de Calcio-infiltración al
autores han estudiado el apoplasto de la el extracto con proteínas intracelulares y vacío-centrifugación, que es una varian-
raíz, pero solo para fines investigativos
y para identificar proteínas específicas Figura 2 - Raíces de las semillas germinadas durante 8 días
en el contexto de la interacción huésped-
patógeno del clavel (Ramirez & Martí-
nez, 2016). Igualmente, Zhang et al.,
(2009) demostraron que las proteínas del
apoplasto de la raíz cumplen funciones
importantes en el mecanismo de res-
puesta al estrés salino del arroz.

Kingsbury & McDonald (2014), plan-
tearon que la pared celular impide el
flujo de biomoléculas de mayor tamaño,
actuando como una red natural y permi-
tiendo que la atraviesen los compuestos
más pequeños. El movimiento libre de
las proteínas de mayor tamaño a través
del apoplasto es más sensible a diferen-
cias imperceptibles en la morfología de
la pared celular. En nuestro caso, el peso
molecular de la GmsPLA2 buscada es
aproximadamente 14 kDa, como fuera
Figura 3 - Recuperación de la proteína total aplicando distintos medios de filtración
descrito en trabajos previos de los auto-
res (Minchiotti et al., 2008; Mariani et
al, 2012). Los mayores rendimientos en
las proteínas de tamaño más reducido
(aproximadamente 15 kDa) fueron obte-
nidos por Witzel et al., (2011) usando
CaCl2 y KCl como componentes de la
solución para infiltraciones en los tejidos
del maíz. Entre todas las soluciones de
extracción evaluadas por Witzel et al., en
el maíz (2011), las que contenían fosfato
de sodio o ácido ascórbico con cloruro
de calcio fueron las más eficientes. La
solución tampón Tris/HCI es un medio
adecuado para la GmsPLA2 (Minchiotti
et al., 2008; Mariani et al., 2012). Ade-
más, se probó que el ion calcio estabiliza
estructuralmente a esta enzima (Mariani
et al., 2012). Por lo tanto, estos com-
puestos estuvieron presentes en nuestras
soluciones para infiltración experimenta-

634 A&G 109 • Tomo XXVII • Vol. 4 • 630-637 • (2017)