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· I NVESTIGACIÓN Y dESARR ollo ·

que pueden ser secretadas en el espacio extracto enzimático primario casi lim- 60 minutos. Durante el paso de infil-
extracelular de los tejidos de las plantas. pio. El procedimiento completo debe ser tración al vacío, el tejido quedó sumer-
viable para la aislación y purificación de gido en la solución para infiltración. El
Existen varios métodos que se usan la GmsPLA2 a gran escala. aire fue desalojado durante la aplicación
comúnmente para extraer el fluido apo- de vacío y la solución para infiltración
plástico de la planta, incluyendo la apli- inundo el espacio extracelular después
cación de presión utilizando una bom- 2. Materiales y Métodos de la liberación del vacío, disolviendo
ba Scholander modificada, perfusión los compuestos apoplásticos. Se aplicó
al vacío, centrifugación, infiltración al 2.1 Material vegetal y condiciones de un vacío de 75 kPa durante 15 minutos
vacío-centrifugación y el método de la crecimiento con un compresor accionado por motor,
tira de papel de filtro (Maksimovic et expulsando el aire extracelular. El vacío
al., 2014). En principio, este último es Las semillas de soja (Glycine max) con genera una presión atmosférica negativa
altamente selectivo para el fluido apo- un poder germinativo de 98 % fueron que crea espacios de aire entre las células
plástico pero solo es adecuado para fines provistas por el Laboratorio de Semillas en el tejido vegetal. El vacío fue reem-
investigativos. Se han aplicado distintas de la Facultad de Ciencias Agropecua- plazado permitiendo que ingrese aire
variantes de la infiltración al vacío-cen- rias (Universidad Nacional de Córdo- de la atmósfera a la cámara del matraz
trifugación para obtener fluido apoplás- ba – Argentina). Para iniciar el proceso y de manera simultánea se infiltró la
tico a partir de diferentes especies vege- germinativo, las semillas se colocaron en solución que ocupó los huecos del tejido
tales (Lohaus et al., 2001). En términos bandejas plásticas sobre hojas de papel (O’Leary et al, 2014). En principio, solo
generales, los tejidos son seccionados absorbente embebidas previamente con se recuperaron las sustancias del espacio
en segmentos reducidos seguidos por agua destilada. Las bandejas se cubrie- extracelular (Lohaus, 2007). Se utiliza-
un lavado intenso y luego se incuban en ron con sobres de plástico negro para ron agua destilada y distintas soluciones
una solución de extracción que se infil- mantener las condiciones de oscuridad. para infiltración (Witzel, et al., 2011).
tra usando cambios de presión inducidos Periódicamente, las semillas se rocia- Además se realizaron ensayos utilizando
por vacío. Por último, las proteínas apo- ron con agua para mantener una hume- soluciones de 50 mM Tris/HCl (pH 7,8),
plásticas solubilizadas se recuperan por dad adecuada y se mantuvieron a 26 °C 20 mM CaCl2, 50 mM KCl, y Tris/HCl
centrifugación. Debido a la recuperación durante 4 días para un ensayo y durante 25 mM-CaCl2 50 mM. Luego, se extra-
selectiva de proteínas secretadas de los 8 días para otro. jeron las muestras de tejidos, se secaron
espacios intersticiales y a la simplicidad con toallas de papel y se colocaron cui-
intrínseca, los procedimientos basados dadosamente en el cilindro de jeringas
en la infiltración al vacío-centrifugación 2.2 Infiltración al vacío–Centrifugación plásticas (10 ml) insertadas en tubos de
pueden reducir los costos de producción la centrífuga. Las muestras fueron cen-
(Kingsbury & McDonald, 2014). Otros Las raíces de las semillas de soja ger- trifugadas durante 15 minutos a 3.000
autores han estudiado específicamente a minadas durante 8 días se separaron rpm (1.310 g) para extraer la solución
las proteínas del apoplasto de la raíz pero utilizando una hoja de afeitar. Luego se apoplástica. Bien por encima de dicha
solo con el propósito de analizar la inte- cortaron en segmentos con una longitud velocidad se informó que hubo daño a
racción huésped-patógeno en el clavel promedio de 6 cm y se lavaron inmedia- las membranas biológicas y contamina-
(Ramirez & Martínez, 2016), o el papel tamente con agua destilada. Las raíces ción del fluido colectado con sustancias
de las proteínas del apoplasto de la raíz seccionadas se enjuagaron para eliminar intracelulares (Maksimovic et al., 2014).
del arroz en el contexto de la respuesta al cualquier suciedad de sus superficies, se El volumen de FA recuperado, - fue de
estrés salino de las plantas (Zhang et al., secaron con toallas de papel, y se pesa- 9,4 ml en un ensayo que utilizó Tris/HCl
2009); pero en ambos casos sin diseños ron para obtener su peso fresco (61,0 g 25 mM-CaCl2 50 mM como solución
preparativos o enfoques tecnológicos. en uno de los ensayos ). Las semillas combinada para infiltración -, siendo a
enteras germinadas durante 4 días (semi- su vez recolectado del fondo del tubo de
Se formuló la siguiente hipótesis: un llas más raíces incipientes) también se la centrífuga (Zhang et al., 2009; Kings-
tratamiento extractivo aplicado directa- lavaron y secaron con toallas de papel bury & McDonald, 2014).
mente al apoplasto de la soja conduce a para avanzar con el paso siguiente. Las
un extracto de PLA2 con menor presen- muestras y la solución de infiltración (60
cia de sustancias contaminantes. Por lo ml), que cubría completamente el mate- 2.3 Determinación de la actividad de
tanto, el objetivo del presente trabajo fue rial vegetal, se colocaron en matraces la PLA2
extraer la enzima PLA2 buscada directa- para vacío tipo kitasato (volumen: 125
mente del apoplasto de la soja, evitando ml). Antes de la infiltración, los matra- La actividad de la PLA2 se obtuvo según
en consecuencia el tratamiento completo ces fueron agitados horizontalmente a Madoery and Minchiotti (2006). Breve-
de las semillas de soja, y produciendo un una velocidad baja y constante durante mente, se usó lecitina de soja (fosfolípi-

632 A&G 109 • Tomo XXVII • Vol. 4 • 630-637 • (2017)