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Fosfolipasa A2 secretora recuperada directamente del apoplasto de la raíz de soja (Glycine max) para su uso en la industria alimentaria

dos, 98-99 %) formando vesículas mul- teínas obtenidas con el método de Lowry 3. Resultados y Discusión
tilaminares grandes en un medio líquido et al., (1951).
como sustratos. Esta forma fisicoquímica Se ensayaron dos sistemas biológicos
inicial nos permitió seguir el progreso de para la obtención del FA: a) semillas
la reacción de hidrólisis porque la absor- 2.4 Purificación de la PLA2 apoplástica germinadas durante 4 días, y b) raíces
bancia aparente (λ 340 nm) se redujo con seccionadas de las semillas germinadas
el tiempo como consecuencia de la for- Se realizó una filtración inicial del FA durante 8 días. Los criterios de selección
mación de las micelas. La acción lipolíti- con papel filtro de malla 11-15 µm, se basaron en el conocimiento específi-
ca de la PLA2 promueve la formación de seguida de una microfiltración al vacío co respecto de la expresión genética de
lisofosfolípidos reorganizándose como con Gamafil™ (nylon, malla 0.22 µm) la soja (Jung et al., 2012) y en la infor-
micelas, que son estructuras supramole- para extraer los agregados o la materia mación obtenida de Genevestigator v.3,
culares más reducidas. Este principio es en suspensión. El filtrado se trató con una plataforma digital utilizada para la
la base del método cinético turbidimé- cromatografía rápida de filtración en gel, investigación de la expresión genética
trico para la medición directa y continua cargando 2,2 ml en una columna Sepha- (Hruz et al., 2008). Dichas contribu-
de la actividad de la PLA2 desarrollada dex™ G-25 M equilibrada con Tris/HCl ciones informaron mayores niveles de
por los autores. Se obtuvieron pendientes 7,8. Un volumen equivalente fue descar- expresión de la GmsPLA2 en los esta-
negativas (-∆A/∆t) aplicando software tado y luego la elución con una solución dios iniciales, también confirmados por
cinético de un espectrofotómetro de arre- tampón de Tris/HCl pH 7,8 nos permitió experimentos preliminares realizados
glo de diodos HP 8452A Hewlett-Pac- aislar la fracción de proteínas con menor por los autores (los resultados no se
kard. Además, se confirmó la hidrólisis peso molecular (3,0 ml) (Sofer & Hagel, muestran). Los ensayos fueron organi-
en posición sn-2 usando cromatografía (1997). Por último, la fracción obtenida zados con diseños comparativos en don-
en capa fina de alta resolución (HPTLC) fue tratada con concentradores centrí- de la composición de la solución para
con lisofosfatidilcolina (LPC) de Sigma fugos para ultrafiltración Vivaspin™ infiltración era la variable experimental
como estándar, pero no se detectó hidró- 6, que son dispositivos equipados con independiente. Las principales variables
lisis en la posición sn-1, ni tampoco la membranas verticales de poliétersulfona de respuesta fueron: la actividad PLA2
formación de productos de otra acción con corte de peso molecular (MWCO) como unidades enzimáticas/g tejido
lipolítica. Una unidad de actividad (U) de 30.000 (GE Healthcare). Los disposi- (rendimiento como U/g), y la activi-
se define como la cantidad de proteínas tivos de muestra fueron centrifugados a dad específica PLA2 como unidades de
que promueve un cambio de 0,001 en las 4.000 rpm (2.325 g) durante 10 minutos. PLA2/mg proteína (pureza como U/mg).
unidades de absorbancia por minuto. La El filtrado y el retentato fueron analiza- Los valores informados representan el
actividad de la PLA2 (U/ml) también se dos para detectar la actividad de la PLA2 promedio de las mediciones de la activi-
expresó como la actividad específica (U/ de acuerdo con lo descrito en la sección dad de la PLA2 realizados por duplica-
mg) a través del contenido total de pro- Materiales y Métodos. do, y llevando a cabo 3 ensayos indepen-
dientes. Los datos obtenidos de los ensa-
Figura 1 - Semillas germinadas durante 4 días yos fueron procesados con Sigma Plot
(Systat Software, Inc) para Windows.

La recuperación de la actividad de la
PLA2 expresada como U/g tejido, es un
parámetro clave desde un punto de vis-
ta tecnológico. El nivel de recuperación
de la actividad de la PLA2 fue clara-
mente superior en las raíces (sistema b,
Figura 2) que en las semillas germina-
das (sistema a, Figura 1) para todas las
soluciones para infiltración ensayadas,
en coincidencia con el conocimiento
sobre la expresión genética de la soja.
Por otro lado, aparentemente también
tuvo un efecto general sobre la proteína
total ya que la masa de proteínas extraí-
das fue marcadamente superior cuando
trabajamos con las raíces seccionadas
(Figura 3). Aunque los valores elevados

A&G 109 • Tomo XXVII • Vol. 4 • 630-637 • (2017) 633