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· I N V e S T I G A C I Ó N Y d e S A R R o l l o ·

suspensión a 9 con solución de NaOH ron muestras de cada fracción durante el de proteínas de aproximadamente 1 mg/
2 N antes de agregar 0,5% de Protex 6L tercer y cuarto ensayo de extracción y se ml y luego se filtraron con una mem-
(peso/peso de láminas extrusadas) y se analizaron para determinar la composi- brana de celulosa regenerada de 0,45
agitó durante 1 hora a 120 rpm y a una ción química, también se calcularon los μm (Millipore Corporation, Billerica,
temperatura de 50 ºC. balances de masa del aceite, las proteí- MA, EE.UU.). El volumen de la inyec-
nas y los sólidos en base a las láminas de ción fue de 10 μl a un caudal de la fase
La reacción se realizó en un reactor soja entrantes. móvil de 1 mL/min. La absorbancia se
de vidrio encamisado de 20 L. La sus- midió a 215 nm. Los marcadores del PM
pensión obtenida en la primera etapa (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) fueron:
de extracción se centrifugó a 3000 × g Recuperación de aceite, proteínas y aprotinina de pulmón bovino (6511 Da),
para separar la fracción insoluble. Luego sólidos cadena B de insulina (3595 Da), acetato
de separar la fracción insoluble, la fase de angiotensina II humana (1060 Da), e
líquida (conteniendo mezclados el sobre- Se realizaron análisis de los contenidos de hidrato de acetato de encefalina-leucina
nadante, la emulsión cremosa y el aceite aceite, proteínas y materia seca (sólidos) (555 Da). Los péptidos fueron cuantifi-
libre) se colocó en un reactor encami- del sobrenadante y la fracción insoluble cados en base a las áreas de los picos en
sado de 5 L, utilizado como un gran como así también de las láminas enteras relación con los marcadores estándar.
embudo de separación y se dejó repo- extrusadas que ingresaron a la extracción.
sar durante la noche a 4 ºC. Luego de la El contenido total de aceite se determinó
sedimentación, la fase liquida se separó utilizando el método Mojonnier de hidró- Electroforesis en gel de poliacrilami-
en tres fracciones (sobrenadante, emul- lisis ácida (Método 922.06 de AOCS), y da con dodecil sulfato sódico (SDS-
sión cremosa y aceite libre). La fracción el contenido de proteínas se determinó PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Pol-
insoluble obtenida en la primera etapa de usando el método Dumas y un factor de yacrylamide Gel Electrophoresis)
extracción (primera fracción de insolu- conversión de nitrógeno a proteína de
bles) fue sometida a una segunda etapa 6,25 (vario MAXCN Elementar Analy- Los perfiles de PM elevados fueron
de extracción. Previamente a la segunda sensysteme GmbH. Hanau, Alemania), determinados con SDS-PAGE luego de
etapa de extracción, la primera fracción los sólidos totales fueron determinados diluir las muestras a una concentración
insoluble se dispersó en agua para obte- por pesada luego de secar las muestras de proteínas de 1,5 mg/ml con 10 mM de
ner un relación sólido/líquido de 1:6 y en una estufa de vacío a 110 ºC durante 3 solución reguladora de fosfato (pH 7,5),
se utilizaron las mismas condiciones de horas (Método 44-40 de AOCS). mezclando 1 parte de muestra con 2 par-
extracción usadas en la primera etapa de tes de solución reguladora (62,5 mM de
extracción. La suspensión obtenida en la Los rendimientos de la extracción fueron Tris-HCl, pH 6,8; 2% de SDS, 25 % de
segunda etapa de extracción se centrifu- expresados como porcentajes de cada glicerol, 0,01% de azul de bromofenol, y
gó para separar la 2da. fracción insoluble componente en cada fracción en relación 5% de 2-mercaptoetanol), calentando la
y la fase líquida. con las cantidades iniciales en las lámi- mezcla en agua hirviendo durante 5 min,
nas sin desgrasar extrusadas. Los análi- y aplicándola en un gel de poliacrilami-
La fase líquida de la segunda extracción sis químicos se hicieron por duplicado da con gradiente de entre 4-15% (Bio-
se recicló a la primera etapa de extrac- sobre las muestras obtenidas de dos lotes Rad Laboratories, Ltd. Hercules, CA,
ción del ensayo realizado al día siguiente de extracción distintos. EE.UU.) utilizando alícuotas de 15-μl
y de dos formas distintas: (1) sin trata- para cargar 7,5 mg de proteínas.
miento térmico (enzima activa en ambas
etapas; Tratamiento 1); o (2) se calentó Cromatografía por exclusión por
la fase líquida a ser reciclada durante 10 tamaño (CET) de los polipéptidos del Ultra y nanofiltración de punto de cor-
minutos a 85 ºC para desactivar la enzi- sobrenadante te de las fracciones de sobrenadante
ma en forma previa a la incorporación a
la primera etapa de la extracción en con- Los polipéptidos de bajo peso molecular Se realizó la ultrafiltración de punto de
tracorriente (Tratamiento 2). (PM) fueron caracterizados utilizando corte a escala de laboratorio con celdas
cromatografía líquida de alta resolución agitadas Amicon con capacidad para 50
El Tratamiento 3 utilizó el mismo méto- (HPLC) con una columna de exclusión y 200 mL (modelos 8050 y 8200; Bille-
do de reciclado del Tratamiento 1, pero por tamaño de 300 mm × 7,8 mm Bio- rica, MA, EE.UU.) y áreas de membrana
sin agregar enzimas en ninguna de las basic SEC 300 (BioRad Laboratories, efectiva de 13,4 y 41,8 cm , respecti-
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etapas de extracción. Las extracciones se Ltd, Hercules, CA, EE.UU.). Las mues- vamente. En el caso de la filtración por
efectuaron de esta manera durante cuatro tras se prepararon en la misma solución membrana de dos etapas, se realizó la
días seguidos, alcanzando el estado esta- reguladora usada como fase móvil (2 M ultrafiltración de 200 g de cada fracción
cionario en el segundo día [17]. Se toma- de guanidina HCl) a una concentración de sobrenadante con celulosa regenerada

150 A&G 86 • Tomo XXII • Vol. 1 • 146-160 • (2012)